Metode Kuantifikasi Kromatografi

Metode kuantifikasi untuk analisis kuantitatif dengan kromatografi ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal, me-tode baku internal, dan metode normalisasi internal'10' serta metode standar adist.

1)Metode baku eksternal

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai baku eksternal karena larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara ter-pisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dalam sistem kromatografi yang digunakan dan dianalsis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan me-tode grafikdari kurva kalibrasi atau secara numerik001.

Gambar 1.10. Kurva baku untuk menghitung sampel dengan menggunakan baku eksternal. 51,52, dan S3 adalah standar eksternal untuk kalibrasi; dan U adalah sampel yang tidak diketahui konsentrasinya"

Larutan baku (kadang-kadang disebut dengan kalibrator) disiapkan dengan konsentrasi tertentu yang sudah diketahui (misal 0,1; 0,2; dan 0,3 mg/mL). Sejumlah tertentu volume larutan ini diinjeksikan dan dianalisis lalu respon detektor (luas puncak atau tinggi puncak) diplotkan terhadap konsentrasi sebagaimana dalam Gambar 1.10.

2. Metode baku internal

Baku internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun demikian senyawa ini harusterpisah dengan baikselama proses pemisahan. Baku internal dapat menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel atau konsentrasi karena variasi instrumen. Salah satu alasan utama digu-nakannya baku internal adalahjika suatu sampel memeriukan per-lakuan sampel yang sangat signifikan. Seringkali perlakuan sampel memeriukan tahapan-tahapan yang meliputi derivatisasi, ekstraksi, filtrasi, dan sebagainya, yang dapat mengakibatkan berkurangnya sampel. Jika baku internal ditambahkan pada sampel sebelum di-lakukan preparasi sampel, maka baku internal dapat mengoreksi hilangnya sampel-sampel ini. 

Syarat-syarat suatu senyawa dapat digunakan sebagai baku in ternal adalah: terpisah dengan baik dari senyawa yang dituju atau dari puncak-puncak yang lain; mempunyai waktu retensi yang ham-pir sama dengan analit; tidak terdapat dalam sampel; mempunyai kemiripan sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan penyia-pan sampel; tidak mempunyai kimiripan secara kimiawi dengan analit; tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian yang tinggi; stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fase gerak; dan mempunyai respon detektor yang hampir sama dengan analit pada konsentrasi yang digunakan"0'.

Dengan metode baku internal, kurva baku dihasilkan dengan mempersiapkan beberapa larutan baku yang mengandung konsen trasi yang berbeda dari senyawa yang dituju dengan ditambah sejum-lah konsentrasi tertentu yang tetap dari larutan baku internal. Sebagai contoh penggunaan baku internal adalah penetapan kadar metomil dengan menggunakan baku internal benzanilid (Gambar 1.11).

Kromatogram yang diberikan pada Gambar 1.11 menggam-barkan metodologi standar internal. Di sini, metomil dikuantifikasi dengan menggunakan benzanilid sebagai standar internal. Dengan menggunakan kurva kalibrasi, kandungan metomil yang tidak di-ketahui dapat dicari dari rasio antara luas kromatogram metomil dibagi dengan luas kromatogram benzanilid02'.

Gambar 1.11. Analisis metomil dengan metode standar internal:

(a) kromatogram; (b) kurva kalibrasi. 1 = benzanilid (standar internal); 2 = metil-N-hidroksitioasetimidat; 3 =- metomil"3'.

Metode standar internal kurang sering digunakan dalam kro-matografi cair dibanding dalam kromatografi gas, karena pada kro-E matografi cair, injeksi secara berulang dapat dilakukan dengan sis-tem injeksi yang teliti dan reliabel02'

3. Normalisasi internal

Untuktujuan analisistertentu,hanyajumlah relatifanalitdalam suatu multikomponen yang dibutuhkan. Hal ini dinormalisasi ke 100atau 1 dengan mengekspresikan jumlah relatif masing-masing analit dalam suatu multikomponen sebagai persentase total (jika digunakan normalisasi 100) atau fraksi (jika digunakan normali-sasi 1). Normalisasi internal merupakan nilai tertentu dalam kroma tografi untuktujuan kuantitatifyang mana beberapa sampel dapat ditentukan secara bersama-sama dan konsentrasi absolut tidak di butuhkan. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi puncak sebanding dengan konsentrasi atau konsentrasi zat yang menghasilkan puncak. Dalam metode yang paling sederhana, diukur lebar atau tinggi puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis'5'.

Komposisi relatif dihitung dari respon alat, dan untuk kasus kromatografi digunakan luas puncak masing-masing komponen dalam suatu campuran menggunakan rumus berikut:

%X1 = Ax / ∑ x 100% 

Yang mana:

x, = salah satu komponen dari sebanyak n komponen 

A = luas puncak atau respon lain yang terukur.

Ada dua hal yang harus diperhatikan jika menggunakan pen-dekatan ini untuk tujuan analisis, yaitu: (i) kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen muncul sebagai suatu puncakyang terpisah pada kromatogram. Hal ini disebabkan komponen-komponen dalam suatu campuran dapat, berkoelusi. ditahan di dalam kolom, atau terpisah secara sempu

tanpa terdeteksi, dan (ii) Rita harus mengasumsikan bahwa Rita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen. Untuk mengatasi kesulitan ini, maka diperlukan kalibrasi detektor.

Untuk menggunakan metode ini datam KCKT, beberapa kon-disi harus dipenuhi: semua analit yang berada dalam sampel yang akan dianalisis harus terelusi dari kolom (tidak ada retensi yang bolak-balik), dengan resolusi yang cukup; dan lebih lanjut semua analit harus terdeteksi. Semua koefisien respon harus diketahui, pa ling tidak diperoleh secara eksperimental. Metode ini tidak dapat digunakan untuk menentukan persentase komponen apapun da lam suatu campuran jika koefisien respon tidak ada. Pada sisi yang lain, keuntungan metode ini adalah bahwa tidak diperlukan untuk mengetahui banyaknya sampel yang diinjeksikan031.

4. Metode standar adisi

Metode standar adisi merupakan teknik analisis kuantitatif yang mana serangkaian sejumlah analit dengan jumlah yang telah diketahui ditambahkan ke dalam sampel041.

Dengan menambahkan satu atau lebih alikuot standar, suatu kurva kalibrasi dapat disiapkan. Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi sebagaimana ditunjukkan oleh Gambar 1.12. Untuk mtode ini, respon analit hams linier di kisaran konsentrasi yang digunakan dalam kurva kalibrasi. Suatu pendekatan praktik dalam metode standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa bagian yang sama lalu menambahkan ke dalamnya standar dengan level konsentrasi yang meningkat. Sampel selanjutnya dianalisis dan respon versus konsentrasi akhir di-p/ot-kan. Konsentrasi akhir standar adalah konsentrasi standar setelah ditambahkan pada sampel. Konsentrasi mula-mula dalam sampel selanjutnya dilakukan dengan ekstrapolasi, padasumbu-x.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.