1.Penjerap/Fase diarn
Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu meka-nisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam si lika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid. Tabel 3.1. meringkas berbagai macam agen pembacem silika141.
2. Fase Gerak pada KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknikyang sensitive
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Ry solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai R^. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dieti! eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan se-dikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi solut-solut yang bersifat basa dan asam151.
3. Aplikasi (Penotolan) sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyakmakaakan menurunkan resolusi.
Penotolan (aplikasi) sampel dapat dilakukan sebagai suatu bercak, pita, atau dalam bentukzig zag (Gambar 3.1). Sering disarankan bahwa sampel yang yang akan ditotolkan berada dalam bentuk yang sesem pit mungkin. Sampel dengan pita yang sempit akan menjamin resolusi yang paling tinggi bahkan ketika sampel mengandung sejumlah kom-ponen dengan perbedaan niiai-nilai Rfyang minimal. Penotolan secara zig zag akan menghasilkan suatu bentuk yang memungkinkan sejum lah sampel dalam jumlah besar ditotolkan tanpa dilakukan pencucian lapisan tipis. Metode ini penting untuk sampel-sampel dalam air
Penotolan sampel secara otomatis
Penotolan sampel dalam Jumlah banyak secara manual membutuhkan waktu yang lama dan juga menghasilkan reprodusibilitas yang kurang bagus. Reprodusibilitas dan kecepatan sering dicapai dengan menggunakan penotol otomatis.
Diagram skematik penotol analitik dengan kontrol mekanik ditunjukkan dalam Gambar 3.2. Motor stepper akan mengontrol kecepatan gerakan sedotan syring; dengan demikian banyaknya sampel per bercak atau per pita dapat dikontrol. Lebih lanjut motor stepper akan menggerakkan lempeng lapis tipis pada arah sumbu x. Parameter-parameter ini diprogram dan dikontrol dengan mikroprosesor.
Gambar 3.2. Diagram syring analitik dengan kontrol mekanis. 1 = sampel; 2 = syring analitik; 3 = aksi kontrol mekanik; 4 == motor stepper; 5 = kontrol motor stepper; dan 6 = lempeng lapis tipis'"".
Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 ul. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda.
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 ul. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 ul maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antartotolan.
4. Pengembangan
Ada beberapa teknik pengembangan pada KLTdan KLT-kinerja tingi atau High Performance-Thin Layer Chromatography (HPTLC) yang akan diuraikan di bawah ini.
a.Konvensional
Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending], yang mana ujung bawah lempeng diceiup-kan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan repro dusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber] harus dijenuhkan dengan uap fase gerak.
Jarak pengembangan fase gerak biasanya kurang lebih 10-15 cm; akan tetapi beberapa ahli kromatografi memilih me ngembangkan lempeng pada jarak 15 - 20 cm. Untuk lempeng KLT-kinerja tinggi (HPTLC), yang mempunyai ukuran partikel !e-bih kecil, maka pengembangan lempeng dilakukan pada jarak antara 3-6 cm.
b.Pengembangan 2 dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkat-kan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mem punyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rjuga hampir sama, sebagaimana dalam sampel asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda da-pat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama.
KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penoto-lan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan me-ngembangkannya sebagaimana biasa dengan eluen pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dipindahkan dari chamber pengembang dan eluen dibiarkan menguap dari lempeng. Selanjutnya, lempeng dimasukkan dalam chamberyang meng-gunakan eluen kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Suksesnya pemisahan tergantung pada kemam-puan untuk memodifikasi selektifitas eluen kedua dibanding-kan dengan selekifitas eluen pertama'9'.
c.Pengembangan Kontinyu
Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara terus-menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan, dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan.
d.Pengembangan gradient
Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan kom-posisi fase gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam bejana dan diaduk sampai homogen.
Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu populer141.
5. Deteksi
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang ti-dak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisi-ka, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan de ngan fluoresensi dibawah sinar ultraviolet. Fluoresensi dengan sinar ultraviolet, terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, akan membuat bercak terlihat lebih jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluo resensi, maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluore sensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam karena menyerap sinar ultraviolet sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresen si. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak:
Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang me-ngandung gugus fungsional tertentu sehinga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng dipanaskan terlebih dahu-lu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensi-tas warna bercak.
Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang pada panjang gelombang emisi 254 atau 366 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi se-ragam. Lempeng yang diperdagangkan dapatdibeli dalam ben-tuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk mem-berikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluoresensi setelah dilakukan pengem-bangan.
Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai keco-klatan.
Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup
Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densi-tometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas f3i-diasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak {peak) da lam pencatat (recorder).
Sumber :
Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar