Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik.
Selainklasifikasidiatas.KCKTjugadapatdikelompokkanberdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut; dengan jenis-jenis KCKTsebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbs!
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dafam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbs! biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor'31.
Fase gerak memegang perananyang penting pada kromatografi adsorpsi. Faktanya, fase gerak dapat memberikan perubahan yang besar dalam karakteristik retensi sampel. Kekuatan pelarut (fase gerak) akan mengontrol nilai faktor retensi semua puncak sampel. Parameter kekuatan pelarut (£°) telah digunakan beberapa tahun Untuk untuk silika dan alumina secara kuantitatif. Parameter kekuatan pelarut didefinisikan sebagai energi adsorpsi pelarut pada penjerap per unit luas pelarut. Tabel 4.3. memberikan nilai kekuatan peiarut (fase gerak) untuk beberapa pelarut yang digunakan dalam kromatografi adsorpsi. Semakin kecil nilai £°menunjukkan pelarut yang semakin lemah, demikian juga sebaliknya. Pelarut-pelarut yang diringkas pada tabel 4.3. merupakan pelarut tunggal. Pada umumnya, fase gerak menggunakan campuran pelarut untuk dengan perbedaan nilai £° yang luas, sehingga akan diperoleh campuran pelarut dengan nilai £°yang diinginkan. Pada akhirnya pengaturan nilai £° ini ditujukan untuk diperolehnya nilai faktor retensi pada kisaran 1 -"lO®.
Tabel 4.3. Pelarut-pelarut yang digunakan dalam kromatografi adsorpsi'81.
Pelarut
Kekuatan pelarut (£°)
n-heksana
0,01 Silika
0,01 Alumina
1-klorobutana
0,20 Silika
0,26 Alumina
Kloroform
0,26 Silika
0,40 Alumina
Isopropil eter
0,34 Silika
0,28 Alumina
Etil asetat
0.38 Silika
0,58 Alumina
Tetrahidrofuran
0,44 Silika
0,57 Alumina
Asetonitril
0,50 Silika
0,65 Alumina
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimo-difikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non- polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C,g) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan airatau dengan larutan bufer. Untuksolutyang bersifatasam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur, maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi, karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat(3).
3. Kromatografi penukar ion
KCKTpenukar ion menggunakan fase diam yang dapatmenukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemi sahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan'2'.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul (BM) > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang berukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang berukuran jauh lebih kecil. Hal ini di-sebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus moleku! yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks'2'.
Skema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien sebagaimana ditunjukkan oleh Gambar 4.3. Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. Meskipun demikian, karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak t'ertahan telah tercucisecarasempurnadari kolom, solut yang tertahandapatdielusi dengan menggunakan pelarutyang mampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini merupakanfasegerakyangkuat dan seringkalidikenalsebagai bufer elusi. Begitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut
Sumber :
Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar