Sistem Peralatan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Sistem Peralatan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detek-tor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair di-tunjukkan dalam Gambar 4.1.

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam [inert). Wadah pe-larut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase ge rak antara 1 sampai 2 liter pelarut0'.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemro-graman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama j'ika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas'4'.

JENIS Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik.

Selainklasifikasidiatas.KCKTjugadapatdikelompokkanberdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut; dengan jenis-jenis KCKTsebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbs!

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dafam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbs! biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor'31.

Derivatisasi Pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifatfisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada KCKTadalah untuk:

1.Meningkatkan deteksi

2.Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik

3.Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik

4.Menstabilkan analit yang sensitif3.

Detektoryang paling banyakdigunakandalam KCKTadalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromoforyang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri17'.

Kromatografi Gas (KG)

Kromatografi gas (KG) merupakan teknik instrumental yang dikenal-kan pertama kali pada tahun 1950-an. KG merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran. Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang ele-ktronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui te knik analisis dengan resolusi yang meningkat0'.

KG menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya. Ada 2 jenis kromatografi gas, yaitu (1) kromatografi gas-cair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam; dan (2) kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa polimerik*2'.

Prinsip dasar kromatografi gas melibatkan volatilisasi atau peng-uapan sampel dalam inlet injektor, pemisahan komponen-komponen dalam campuran, dan deteksi tiap komponen dengan detektor'3'.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Sistem Peralatan Kromatografi Gas

Sistem peralatan KG ditunjukkan oleh Gambar 5.1. dengan komponen utama adalah:

1.Kontrol dan penyedia gas pembawa;

2.ruang suntiksampel;

3.kolom yang diletakkan dalam oven yang dikontrol secara ter-mostatik;

4.sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder); serta

5.komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data'2'

Gambar 5.1. Diagram skematik pada KG'2'.

Derivatisasi Pada Kromatografi Gas

Derivatisasi pada KG merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas (men jadi lebih mudah menguap). Alasan dilakukannya derivatisasi:

Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan KG terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.

Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan KG.

Bahan Dan Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1.Penjerap/Fase diarn

Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu meka-nisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam si lika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b.

Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid. Tabel 3.1. meringkas berbagai macam agen pembacem silika141.

Densitometri pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatifanalit-analit dengan kadar kecil, yang mana diperlu-kan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT*2'.

Untuk evaluasi bercak hasil KLTsecara densitometri, bercak di-scan-'ung dengan sumber sinar dalam bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik panjangnya maupun lebarnya. Sinar yang dipantulkan diukur de ngan sensor cahaya (fotosensor). Perbedaan antara signal optik daerah yang tidak mengandung bercak dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan dengan banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam lempeng yang sama. Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan fluoresensi0'. Kebanyakan pengukuran kromatogram lapis tipis dilakukan dengan cara absorbansi. Kisaran Ultraviolet rendah (di bawah 190 nm sampai 300 nm) merupakan daerah yang paling berguna01.

Kromatografi Lapis Tipis – Kinerja Tinggi (KLTKT)

Kromatografi lapis tipis-kinerja tinggi atau High Performance-Thin Layer Chromatography (HPTLC) dimaksudkan untuk menghasilkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih baik dibanding dengan KLT biasa. Kelebihan KLTKT dibanding dengan KLT terletak pada fase

diamnya, yang mana pada KLTKT digunakan fase diam berukuran halus dan pori-porinya seragam serta mempunyai ketebalan lapisan 0,1 mm. Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil ini akan.menyebabkan semakin besarnya jumlah lempeng teoretis (N), karenanya pemisahan menjadi lebih ensien.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Validasi Metode Dalam Kromatograsi

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, re-produsibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat, validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika: Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis

Tertentu Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan, atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi Panjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baru dan metode baku0'.

Metode Kuantifikasi Kromatografi

Metode kuantifikasi untuk analisis kuantitatif dengan kromatografi ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal, me-tode baku internal, dan metode normalisasi internal'10' serta metode standar adist.

1)Metode baku eksternal

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai baku eksternal karena larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara ter-pisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dalam sistem kromatografi yang digunakan dan dianalsis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan me-tode

Penyiapan Sampel Pada Kromatografi

Dalam banyak hal, sediaan obat tidak dapat dianalisis secara lang-sung dengan metode kromatografi tanpa didahului dengan ta-hap perlakuan/penyiapan sampel. Penyiapan sampel dapat dilakukan dengan cara sederhana seperti filtrasi, ataupun dengan cara yang agak kompleks dengan melibatkan prosedur ekstraksi fase padat (solid phase extraction). Penyiapan sampel merupakan kegiatan yang dibutuhkan untuk menyiapkan sampel yang akan dianalisis. Tujuan utama penyiap-an sampel adalah untuk menyediakan komponen yang dituju (analit) dalam suatu larutan, yang bebas dari gangguan atau interferen'6'.

Istilah-istilah komponen, analit. dan interferen sering digunakan dalam buku ini. Suatu komponen merupakan spesies kimia apapun yang ada di dalam sampel. Analit merupakan spesies kimia yang kon-sentrasinya akan kita selidiki atau yang kita tuju. Penganggu (interferen) merupakan spesies kimia apapun, yang konsentrasinya tidak kita ke-hendaki171.

Tahap penyiapan sampel pada umumnya dikelompokkan menjadi tahappengambilan sampel (sampling) dan tahap pembersihan sampel (dean up).Tujuan akhir pengambilan sampel adalah untuk memperoleh sampel yang representatif (mewakili) dari suatu batch sediaant farmasi"'.

Bab ini akan membicarakan tentang cara pengambilan sampel j (sampling) dan prosedur penyiapan sampel untuk sediaan-sediaan farmasi.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.

PENGAMBILAN SAMPEL PADA KROMATOGRAFI

engambilan sampel merupakan masalah yang sangat penting dalam analisis kimia sebab untuk mengetahui kadar atau konsentrasi suatu senyawa tertentu dalam sampel, hanya dilakukan terhadap se-jumlah kedl sampel. Oleh karena itu, cara pengambilan sampel yang salah meskipun metode analisisnya tepat dan teliti hasilnya tidak akan memberikan petunjuk yang benar mengenai sifat (dalam hal ini kadar) yang akan diselidiki. Meskipun demikian, masalah ini seringkali kurang mendapat perhatian dari seorang analis disebabkan para analis sudah terbiasa menerima sampel yang langsung dianalisis*2'.

Pengambilan sampel sediaan obat Pada Kromatografi

Pada dasarnya sediaan parenteral sudah homogen. Untuk lot yang kecil (biasanya 3000 dos) dilakukan analisis 2 unit sediaan obat secara duplikat0'.

Tablet dan bentuk sediaan sejenis

Pencampuran suatu formulas! yang mengandung bahan aktif de-ngan suatu bahan tambahan seringkali dilakukan dalam suatu uku-ran lot yang mana proporsi kandungan bahan aktif terhadap massa total adalah kecil.

Sampel-sampel bentuk sediaan padat dapat diambil dengan melakukan pengujian unit individual atau suatu sampel komposit dari unit-unit individual. Pengambilan sampel pada suatu unit in¬dividual dilakukan ketika kisaran nilai dalam unit-unit terpisah adalah besar dan/atau ketika diperlukan suatu keberagaman unit. Pengambilan sampel komposit dilakukan ketika homogenitas bu-kanlah suatu masalah yang berarti atau ketika keberagaman unit bukanlah sesuatu yang penting01.

Sediaan-sediaan yang lain

Sediaan-sediaan seperti gel, lotion, dan suspensi sebelum dianalisis harus dicampur secara homogen.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.

TEKNIK PENYIAPAN SAMPEL PADA KROMATOGRAFI

Produk-produk farmasetik dan bahan-bahan biologis bersifat sa-ngat kompleks dan biasanya mengandung senyawa-senyawa ga-ram, asam, basa, protein, dan beberapa senyawa organik dengan sifat fisika-kimia yang hampir sama dengan analit yang dituju. Lebih lanjut, analit biasanya berada dalam konsentrasi yang sangat kecil dalam sam-pel-sampel ini. Meskipun analisis-analisis farmasetik dilakukan dengan menggunakan berbagai macam instrumen analitikyang sangat efisien, suatu prosedur penyiapan sampel biasanya dibutuhkan untuk mengeks-traksi dan mengisolasi analit yang dituju dari matriks yang kompleks ini karena instrumen-instrumen tidak dapat menangani matriks secara langsung01.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga dise-but dengan HPLC {High Performance Liquid Chromatography] di-kembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas un tuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik, sertaobatdalam cairan biologis01.

Sumber :

Rohman, Abdul. 2009. Kromatigrafi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.